易错PCR获得木聚糖酶XYNH突变株筛选

易错PCR获得木聚糖酶XYNH突变株筛选

（一）项目简介

易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。

易错PCR技术获得木聚糖酶XYNH突变株筛选，是通过易错PCR技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖酶的降解能力、耐热性、酶活性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。

（二）国内外研究现状和发展动态

   1.国内外研究现状

木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。

国外对木聚糖酶的研究开始的较早。Sorensen，1955年就对动物瘤胃和土壤中的木聚糖酶进行了研究。1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达等（Neeta等，1999；Raffaele等，2004）。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。

我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士(曾宇成等，1987)的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶（Aspergillus phoenicis）中纯化得到了四种木聚糖酶：酶I、酶Ⅱ、酶Ⅲ和酶Ⅳ，并深人研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等（曲音波等，2001）开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp. G6-2分离出两种木聚糖酶XynA和XynB。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。

  2.发展动态

 国内外目前对木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐热性及低温酶活性。

木聚糖酶原酶在国内外市场的发展迅速，占了酶制市场份额的12%左右。世界上规模化生产木聚糖酶的国家有许多，例如：丹麦、爱尔兰、芬兰、日本、加拿大等国家。由于木聚糖酶的半纤维素降解中作用显著，能够将半纤维资源在温和条件下转化为糖，具有很高的经济价值。所以近几年来，各国的科研工作者不断在食品、造纸、饲料、能源与环境等方面研究木聚糖酶的应用技术，并且已经成为各国的科研工作者研究的热点之一，在这方面做出新的突破。

（三）研究目的

    研究目的是提高木聚糖酶在低温条件下的酶活性。

    木聚糖酶在生物工程中有重要的应用价值，但是生物工程的作用环境往往比较苛刻，所以要求木聚糖酶的物理化学特性比较稳定。如在纸浆和造纸工业中，要生产纸浆需要对木材在高温和较碱性的环境进行处理，纸浆处理的温度大约在60°C，而处理纸浆所采用的pH值在10-11之间；然而很多木聚糖酶最适作用温度在50-60°C ，在55°C作用半寿期是一个小时。一般情况下，真菌来源的木聚糖酶在pH4-6酸性范围内起作用；放线菌来源的木聚糖酶和细菌来源的木聚糖酶在pH5-9较广范围内起作用。不仅在造纸业中使用的木聚糖酶需要较高的耐热性和耐碱性，在酿造、饲料、生物降解以及能源与环境中使用的木聚糖酶也需要较高的耐热性和耐碱性。由此看来，在高温和较碱性pH值有较高活性的木聚糖酶需要比较强烈。所以我们的研究的目的就提高木聚糖酶的耐热性和耐碱性。

（四）研究内容

木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，占植物细胞干重的35%，是一种丰富的生物质资源，是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖的结构是一种多聚五碳糖，由β-D-1,4木糖苷键连接起来，并带有多种取代基。木聚糖部分降解可形成低聚木糖，彻底降解则得到五碳单糖：木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖为主。

木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。

木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。

从自然界分离的木聚糖酶大多数反应的最适温度为50°C—60°C，来源不同地木聚糖酶在热稳定性方面存在巨大差异。通常在一定范围内，酶的反应最适温度与热稳定性成正比，即反应最适温度高的木聚糖酶其热稳定性也较好。大部分来源于细菌和真菌的木聚糖酶，其最适反应温度偏低，也不具有能够满足工业生产要求的热稳定性，但研究发现部分放线菌类所分泌的木聚糖酶具有较高的热稳定性，这在实际生产应用方面具有极大的应用潜力和研究价值。

对那些具有良好热稳定性的木聚糖酶进行研究，发现多种因素和结构参数能够对其嗜热性和热稳定性产生影响。例如：热稳定结构域（TSD）、二硫键、离子键、芳香族氨基酸等因素。

木聚糖酶的水解反应主要为双替换机理，这与其它糖苷水解酶类的催化机理相似。木聚糖酶中一个谷氨酸（Glu）作为催化剂，另一个谷氨酸（Glu）作为亲核试剂，通过两个谷氨酸（Glu）的酸-碱机制催化来实现它的水解作用。研究表明木聚糖酶反应的最适pH条件其实是与酸-碱催化剂周围的氨基酸的极性或非极性、带电荷或不带电荷、带正电或带负电这些性质密切相关。

木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域,目前对于木聚糖酶的研究热点主要有以下几方面:

1.对木聚糖酶作用的分子机理的了解;

2.通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质,研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品;

3.从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶;

4.采用基因工程手段改良菌种,以获得更多的高产菌株;

5.优化发酵条件,进一步提高木聚糖酶的合成水平。

现有的国内外文献关于酶活的测定介绍大多笼统,而且测定方法中各项指标都不统一,同类产品的酶活测定值没有可比性。因此,本文就木聚糖酶酶活测定及pH值、温度等关键因素对酶活测定值的影响进行了进一步的研究,并提出木聚糖酶酶活的测定方法。

（五）创新点与项目特色

   1. 创新点

①木聚糖酶在低温条件下运用于许多方面，所以提高其低温酶活性具有很大发展前景。

②木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。而木聚糖类纤维素是一种重要的能源，广泛的存在于自然界中。对木聚糖酶的研究具有很强的前景。

③木聚糖酶应用在生产的许多方面，具有很强的研究开发前景。

④木聚糖酶的来源较为广泛，可以从细菌、放线菌、真菌以及某些酵母中分离得到。

⑤通过易错PCR技术，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目    的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

   2.项目特色

木聚糖酶在自然界分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得，因而实验的原材料来源广泛。通过易错PCR技术获得木聚糖酶XYNH突变株筛选，易错PCR技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖酶的降解能力或者耐热性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。

易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 

（六）技术路线、拟解决的问题及预期成果

   1.技术路线

   2.拟解决的问题

①易错PCR技术在使木聚糖酶突变产生的不同结果，筛选所需的突变株。

②用水浴法、底物染色法等对酶活性进行测定。

③结合木聚糖酶的特性，进一步对筛选的突变株进行分析。

   3.预期成果

①分离提取木聚糖酶。易错PCR处理后，筛选出耐热性提高的木聚糖酶或者有用的突变体，达到有效减少资源的浪费；

②学会测定木聚糖酶的活性；

③通过筛选耐热性的突变株，了解木聚糖酶的耐热性效应；

④阐明木聚糖酶的提高耐热性作用机制；

⑤项目后期完成一篇论文并发表；

⑥锻炼团队成员的合作学习与实验操作的能力；

⑦培训本团队成员的科研意识，使他们具有较扎实的微生物学和分子生物学实验技能，以及较强的科研组织能力；

⑧训练本团队成员的创新意识，激发他们创新创业思维。

（七）项目研究进度安排

2016年12月-2017年3月    查文献，制定研究计划。

2017年4月-2017年5月    易错PCR技术处理

2017年6月-2017年9月    筛选木聚糖酶XYHN突变株。

2017年10月-2017年12月  耐热性的测定及其的研究。

2018年1月-2018年4月    木聚糖酶耐热性机制的研究 撰写结题论文。

（八）已有基础

   1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

申请人及合作者均已学完微生物学、细胞学、微生物实验等课程，能完成相关的实验操作，对本课题的研究具有浓厚的兴趣。因此，有信心完成本课题的研究。项目指导老师在指导大学生课后科研创新方面具有丰富的经验，主持或参与的科研项目：湖北省对外科技合作项目(2013BHE016), 2013-2015年；人社部留学人员科技活动择优资助基金优秀类项目(2008-86), 2008-2010年；科研成果及荣誉2004年入选东湖国家高新区“3551人才计划”；2016年入选为湖北省科学进步三等奖。所有这些都为本项目的顺利完成奠定了坚实的基础。此外，已有相关木聚糖酶耐热性研究的报道，这为本项目的顺利开展奠定了基础。

①此之前对木聚糖酶生理功能的研究，各国的科研工作者不断在食品、造纸、饲料、能源与环境等方面研究木聚糖酶的应用技术，并且已经成为各国的科研工作者研究的热点之一，在各个方面做出新的突破。在此研究也为此创新提供了思维切入点。

②木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。

   2.已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法

①已具备的条件

通过前期的实验课学会一些实验的动手能力，并在国内核心期刊发表的论文《嗜热真菌木聚糖酶1YNA及其双硫键突变体在毕赤酵母中的表达》，本项目将在此基础上，围绕木聚糖酶的活性产物展开研究。本项目成员已掌握了微生物的分离技术，微生物的培养以及培养基的制备等实验操作技能，并且掌握了微生物学、PCR扩增技术、转化技术的理论知识，以及对分子生物学的理论知识有一定了解。本小组成员具有创新精神，能积极地发现问题并提出解决问题的方法，具有团队合作精神，并能够坚持不懈。

②尚缺少的条件及解决方法

由于课程安排，本项目成员对分子生物学以及分子生物学分析方法的知识欠缺，所以在整个项目进程中，小组成员会加强对这方面知识的了解，不断查阅文献，阅读书籍，以弥补理论知识的欠缺；再者，由于目前接触的实验有限，小组成员可能对实验中某些操作可能会不熟悉，不规范，甚至不会，这就要求在实验过程中，我们要认真地跟着老师学，虚心地向老师、学长和学姐请教，掌握实验的操作步骤，并能够自行解决实验中出现的问题。